Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

Moderne Infrarotspektrometer nutzen den Fourier-Transform Ansatz: Anstatt wie in konventionellen Spektrometern ein Gitter zur Selektion der Wellenlänge zu bewegen, wird ein Michelson-Interferometer eingesetzt. Um ein Spektrum aufzunehmen, wird einer der beiden Spiegel bewegt und die resultierende Intensitätsänderung am Detektor in Form eines Interferogramms aufgezeichnet. Mit Hilfe der Fourier-Transformation wird daraus ein Spektrum generiert.

FT-IR und Wasser: Spektroskopie unter abgeschwächter Totalreflektion (ATR)

Die Untersuchung von biologischen Proben unter physiologischen Bedingungen erfordert eine Präparation der Probe in einer wässrigen Lösung. Dies führt zu massiven Schwierigkeiten bei der Anwendung der Infrarotspektroskopie, da das Wasser in wichtigen Bereichen des Spektrums stark absorbiert. Die ATR (“attenuated total reflection”) Technik stellt eine elegante Lösung dieses Problems dar: der Infrarot- Messstrahl wird unter interner Totalreflektion in einen im infraroten durchlässigen Kristall eingekoppelt. An der Grenzfläche zum äußeren Medium (z.B. Protein oder Puffer) bildet sich eine evaneszente Welle aus. Diese zeigt eine Eindringtiefe im Mikrometerbereich und kann daher benutzt werden, um ein Absorptionsspektrum des äußeren Mediums aufzunehmen. Die Menge an Wasser auf der Kristalloberfläche hat keinen Einfluss auf das gemessene Absorptionsspektrum, was einen Austausch der Pufferlösung bei gleichzeitiger Beobachtung der Veränderungen ermöglicht.

ATR




Zeitaufgelöste FT-IR-Spektroskopie: die Step-Scan-Technik

Die naheliegendste Weise, eine zeitaufgelöste Messung im Infraroten durchzuführen ist es, den Spiegel des Interferometers so schnell wie möglich zu bewegen. Die Step-Scan-Methode überwindet die damit verbundenen mechanischen Einschränkungen und ermöglicht eine Zeitauflösung im Nanosekundenbereich. Der Spiegel wird an einer bestimmten Position angehalten und ein Zeitverlauf wird aufgenommen. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis genügend Punkte für ein komplettes Interferogramm erreicht sind. Zum Abschluss wird die Fourier-Transformation durchgeführt, wodurch ein Datensatz mit Spektren zu definierten Zeitpunkten erhalten wird. Bei Proteinen muss man für ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis einige tausend Zyklen aufnehmen.

stepscan