ATR FT-IR an gasverarbeitenden Enzymen

Wir untersuchen die Biogenese und den katalytischen Mechanismus gasverarbeitender Eisenschwefel-Proteine. Hierbei konzentrieren wir uns auf Hydrogenasen, prähistorische Redox-Enzyme, die sowohl die Oxidation als auch die Abgabe von molekularem Wasserstoff (H2) katalysieren. Hydrogenasen gehören zur enzymatischen Grundausstattung vieler Bakterien, wurden aber auch in Eukaryonten wie Hefen und Grünalgen beschrieben. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des bioanorganischen Kofaktors werden [NiFe]- und [FeFe]-Hydrogenasen unterschieden. Da die Eisenzentren in beiden Fällen mit Kohlenmonoxid (CO) und Zyanid-Liganden (CN) substituiert sind, eignet sich die Fourier-transformierte Infrarotspektroskopie (FT-IR) in besonderer Weise für die Analyse dieser Enzymklasse.

Biogenese des Kofaktors der [NiFe]-Hydrogenasen

Die Biogenese von CO und CN in der lebenden Zelle erfordert engmaschige enzymatische Kontrolle. In E. coli z.B. braucht es mindestens sechs Proteine, um das Eisen-Ion des Kofaktors mit zwei CN- und einem CO-Liganden zu versehen. Mit Hilfe von FT-IR im Modus der verminderten Totalreflexion (ATR) konnten wir die komplette Fe-(CN)2CO Signatur einer funktionalen [NiFe]-Hydrogenase auf dem Hilfsprotein HypD identifizieren. Ein Indiz für die Herkunft des CO-Liganden lieferte die charakteristische CO2-Absorbtion von HypC, einem Hilfsenzym, das immer im Komplex mit HypD auftaucht. Ein Austausch der natürlichen 12CO Liganden gegen 13CO konnte zeigen, dass das Eisen-Ion erst mit CO modifiziert wird, und erst in zweiter Instanz mit CN. Die Analyse der Hilfsenzyme HypE und HypF schließlich half bei der Aufklärung der Redoxchemie, die die in-vivo Ligation des Eisen-Ions mit CN treibt.

Der katalytische Mechanismus der H2 Oxidation mit [FeFe]-Hydrogenasen

Das aktive Zentrum der [FeFe]-Hydrogenase besteht aus einem [4Fe4S]-Cluster, der über ein einzelnes Cystein elektronisch mit der [FeFe]-Gruppe gekoppelt ist. Diese trägt drei CO- und zwei CN-Liganden sowie einen speziellen Dimethylamin-Liganden, der über zwei Schwefelatome mit der [FeFe]-Gruppe verbunden ist. Mit Hilfe von ATR FT-IR verfolgen wir den Effekt von variierenden Protonenkonzentrationen sowie den Einfluss von H2, O2, CO und N2.

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